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    熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)的詳細(xì)介紹：

　　熒光原位雜交(FISH)技術(shù)檢測(cè)組織中的DNA或RNA序列，那他能不能檢測(cè)microRNAs呢？提到miRNAs，我們首先想到的是他們非常小，確實(shí)它們是很短的單鏈RNA分子，只有18-23個(gè)核苷酸。由于他們很小，所以對(duì)FISH技術(shù)的可行性有很多擔(dān)憂，比如探針能否具有足夠的敏感性和特異性，什么樣的探測(cè)系統(tǒng)適合于來(lái)自這些短的目標(biāo)序列的信號(hào)等等。

　　miRNAs在FFPE組織中的完整性

　　很有趣的是，研究表明相比于mRNAs, miRNAs在福爾馬林固定的石蠟包埋組織(FFPE)中能夠更好地保存。正是因?yàn)樗麄兊捏w積小, 可以和大的蛋白復(fù)合物緊密結(jié)合，使得它們能夠忍受這個(gè)過(guò)程。不過(guò)，需要一直保持沒(méi)有RNAse污染的環(huán)境，經(jīng)常我們會(huì)使用DEPC水來(lái)準(zhǔn)備溶液。當(dāng)然，實(shí)驗(yàn)需要的任何器具都需要提前進(jìn)行高壓滅菌。

　　熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)抗原修復(fù)

　　經(jīng)過(guò)福爾馬林固定交聯(lián)會(huì)限制探針和試劑，使它們不能接近目的miRNAs，可以用抗原修復(fù)術(shù)來(lái)暴露這些位點(diǎn)。大多數(shù)protocols會(huì)使用含有蛋白酶K的 tris緩沖液中來(lái)打破甲醛交聯(lián)，也有一些報(bào)告，蛋白酶K可能會(huì)破壞一些抗原表位，建議在檸檬酸緩沖中加熱樣本。這兩種方法都會(huì)有效, 可以探索哪種更適合自己的樣本。

　　熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)探針選擇

　　曾經(jīng)有人探索使用標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行miRNAs的FISH實(shí)驗(yàn)，但由于目標(biāo)序列太短，雙鏈穩(wěn)定性差，而且與緊鄰的相關(guān)miRNAs有很高的序列相似性，使得很難達(dá)到足夠的特異性?，F(xiàn)在我們通常使用表現(xiàn)更好的Locked DNA(LNA)探針來(lái)實(shí)現(xiàn)這一過(guò)程。

　　Locked DNA是一類DNA類似物，糖環(huán)上被鎖定在一個(gè)亞甲基橋，使得探針在N構(gòu)象穩(wěn)定，因此LNA探針是結(jié)合的佳選擇， 它們?cè)诟叩臏囟认聦?shí)現(xiàn)更高的親和力和穩(wěn)定性。*匹配的雙鏈和錯(cuò)配之間所需溫度不同，所以更容易找到一個(gè)雜交溫度可以只檢測(cè)的匹配,而且，LNA/miRNA雜交體可以抵抗核酸酶的攻擊。

　　對(duì)照探針

　　確保使用陽(yáng)性和陰性對(duì)照探針,特別是設(shè)置程序時(shí)。陽(yáng)性對(duì)照是檢測(cè)存在于特定組織中的miRNA，陰性對(duì)照設(shè)置兩個(gè)探針，其中一個(gè)含有兩處錯(cuò)配，另一個(gè)是針對(duì)你所要檢測(cè)的組織中已知的不會(huì)表達(dá)的miRNA具有特異性。如果你難以區(qū)分背景噪音的信號(hào),你應(yīng)該還設(shè)置一個(gè)‘no probe’對(duì)照.

　　熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)雜交和洗滌

　　先在50°C進(jìn)行兩個(gè)小時(shí)的預(yù)雜交，然后再與探針進(jìn)行雜交過(guò)夜，溫度也是在50°C. 之后進(jìn)行嚴(yán)格的洗滌步驟，這是去除非特異性反應(yīng)的關(guān)鍵步驟。洗滌是在SSC緩沖液中，先是在37°C進(jìn)行洗滌, 以去除多余的探針和雜交緩沖液，然后在50°C進(jìn)行振蕩洗滌，以消除非特異性和重復(fù)性的雜交。如果非特異性結(jié)合仍然是一個(gè)問(wèn)題,試著重復(fù)洗幾次。如果你剛剛開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，可以探索下不同的雜交和洗滌溫度，可能上下兩度的的差異會(huì)帶來(lái)很大的不同。

　　熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)探針標(biāo)記和信號(hào)檢測(cè)

　　市場(chǎng)上有很多種寡核苷酸標(biāo)記示蹤劑以供選擇。生物素被用作5’端耦合，適合進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。如果你的組織是豐富的內(nèi)源性生物素,dioxigenin應(yīng)該是你的選擇。結(jié)合anti-label抗體后,用辣根過(guò)氧化物酶系統(tǒng)將信號(hào)放大。還可以選擇一個(gè)合適的熒光基團(tuán)為HRP底物，常使用的是花青染料, Alexa系列或Quasar染料也是一種選擇。根據(jù)所需的ex/em，雙標(biāo)等選擇合適的標(biāo)記。

    熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)FFPE組織中miRNAs有很多優(yōu)勢(shì)，可以使miRNAs在復(fù)雜組織中的確定位置形象化地體現(xiàn)，可以進(jìn)行大量樣本的檢測(cè)。隨著科學(xué)發(fā)展，還可以同時(shí)檢測(cè)蛋白質(zhì)標(biāo)記的miRNA,以及多元miRNA FISH技術(shù)。無(wú)論在癌癥領(lǐng)域還是發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域，miRNA研究都是具有無(wú)限潛力的！

       1對(duì)于熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)操作來(lái)說(shuō)，那些因素比較重要？

　　在FISH中重要的因素是溫度、光照、濕度和各種試劑的PH值。溫度和濕度直接影響著探針和目標(biāo)DNA的雜交效率；光照影響了熒光染料的強(qiáng)度，因此探針要避光保存，其已經(jīng)雜交的片子可用防熒光淬滅劑封片且避光保存；各種試劑pH也要達(dá)到要求，這也直接關(guān)系到FISH的穩(wěn)定性。

　　2 如何保證熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)操作中的溫度？

　　措施是使用一些FISH的儀器進(jìn)行操作，如Vysis的Hybrit FISH雜交儀。如果是手工操作，首先要對(duì)FISH操作過(guò)程中可能使用的一些儀器進(jìn)行溫控能力的檢查，如水浴鍋、孵箱，對(duì)其中不符合要求的要進(jìn)行更換（疾病診斷中的探針要求溫控精度在0.5度以內(nèi)）。其次，要盡可能地保持操作環(huán)境溫度在20度以上，對(duì)于在冬季進(jìn)行的FISH操作尤為重要。此外對(duì)于需要預(yù)熱以達(dá)到要求溫度的試劑，在使用前必須使用溫度計(jì)對(duì)其進(jìn)行測(cè)溫。同時(shí)檢測(cè)的樣本好不能超過(guò)4塊。操作中的行動(dòng)一定要迅速。操作者還往往忽視一些小部件的溫度，諸如載玻片和蓋玻片。特別是在冬季，蓋玻片本身溫度就低，加之探針的量本就不多（10ul），因此事先沒(méi)有預(yù)熱的蓋玻片會(huì)使得雜交液的溫度急劇下降嚴(yán)重地影響了探針和目標(biāo)DNA的雜交效率。因此對(duì)上述小部件的要進(jìn)行預(yù)熱處理，不然會(huì)影響FISH的雜交效果。

　　3 使用熒光顯微鏡觀察結(jié)果時(shí)，初有清晰而明亮的信號(hào)，但隨后信號(hào)急劇衰減，幾分鐘后信號(hào)就消失了。這是探針本身的質(zhì)量問(wèn)題嗎？

　　正常情況下，商業(yè)化探針即使是雜交后，如保存適當(dāng)，熒光信號(hào)能保持半年以上。出現(xiàn)上述情況主要的原因是操作觀察的過(guò)程中或是探針的保存過(guò)程中沒(méi)有采取嚴(yán)格的避光措施。陽(yáng)光或是強(qiáng)的燈光都會(huì)使熒光染料發(fā)生急劇的淬滅，從而造成了觀察結(jié)果的不穩(wěn)定。因此在操作和觀察時(shí)，盡可能在暗室中操作，也可以在封片觀察時(shí)加入一定的antifade（抗淬滅劑）以延緩熒光素的淬滅。

　　4 如何配制熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)各種試劑呢？

　　強(qiáng)烈建議使用滅菌去離子水配制各種所需的試劑。此外，配制后使用pH計(jì)檢測(cè)是否符合要求。配制的各種試劑都要采用超純級(jí)要求。每次FISH使用新的試劑，舊的試劑好棄置不用。洗脫液和變性液當(dāng)天用當(dāng)天配。

　　5 熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)直標(biāo)型探針和間標(biāo)型探針有何不同？

　　為什么我們要選擇直標(biāo)型探針？所謂的直標(biāo)型探針是指DNA探針共價(jià)連接熒光素基團(tuán)；間標(biāo)型探針則是指DNA探針先與某個(gè)半抗原連接，諸如生物素或，然后半抗原與熒光素基團(tuán)連接從而形成探針－半抗原－熒光素基團(tuán)，類似“三明治”的復(fù)合物。與間標(biāo)型探針相比，直標(biāo)型探針具有低背景、高特異性的特點(diǎn)。隨著熒光染料和熒光檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，直標(biāo)型探針的靈敏度也不斷提高。因而在FISH檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是在疾病分型領(lǐng)域，探針大多采用直標(biāo)型設(shè)計(jì)。

　　6 能對(duì)同一樣本進(jìn)行多次的熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)操作嗎？

　　在多數(shù)情況下，如果FISH操作沒(méi)有得到正常的結(jié)果，我們可以將探針洗去，然后使用同樣的探針進(jìn)行再次的雜交。如果我們使用的是直標(biāo)型探針，還可以使用不同探針對(duì)同一樣本進(jìn)行反復(fù)雜交。針對(duì)不同的樣本，處理方法略有不同。外周血樣本的處理： 1、使用鑷子小心地揭去雜交區(qū)的蓋玻片 2、將樣本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各一分鐘以便充分地脫水。將片子風(fēng)干后就可以進(jìn)行重復(fù)的雜交了。二次雜交中建議將變性的時(shí)間縮短一半，但不得少于3分鐘。如果對(duì)同一樣本還要進(jìn)行三次雜交，變性的時(shí)間就無(wú)需減少了。對(duì)于多次雜交，復(fù)染液濃度的降低有利于保持探針的亮度。曾有報(bào)道在同一樣本片上進(jìn)行了多達(dá)8次的FISH操作。也可對(duì)已經(jīng)進(jìn)行G帶顯色的樣本片進(jìn)行FISH操作：將樣本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各二分鐘以便充分地脫水。將片子風(fēng)干后就可以進(jìn)行重復(fù)的雜交了。二次雜交中建議將變性的時(shí)間縮短一半，但不得少于3分鐘。如果對(duì)同一樣本還要進(jìn)行三次雜交，變性的時(shí)間就無(wú)需減少了。

　　8 熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)技術(shù)有哪些主要優(yōu)勢(shì)：

　?、?/span> 安全、快速、靈敏度高；

　　② 探針能較長(zhǎng)時(shí)間保存；

　?、?/span> 多色標(biāo)記，簡(jiǎn)單直觀；

　?、?/span> 可用于中期染色體及間期細(xì)胞的分析；

　?、?/span> 可應(yīng)用于新鮮、冷凍或石蠟包埋標(biāo)本以及穿刺物和脫落細(xì)胞等多種物質(zhì)的檢測(cè)。

      熒光原位雜交fish檢測(cè) 應(yīng)用在醫(yī)療行業(yè)：

熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)(Florescence In-Situ Hybridization簡(jiǎn)稱FISH)是一種利用非放射性的熒光信號(hào)對(duì)原位雜交樣本進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)。它將熒光信號(hào)的高靈敏度、安全性，熒光信號(hào)的直觀性和原位雜交的高準(zhǔn)確性結(jié)合起來(lái)，通過(guò)熒光標(biāo)記的DNA探針與待測(cè)樣本的DNA進(jìn)行原位雜交，在熒光顯微鏡下對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行辨別和計(jì)數(shù)，從而對(duì)染色體或基因異常的細(xì)胞、組織樣本進(jìn)行檢測(cè)和診斷，為各種基因相關(guān)疾病的分型、預(yù)前和預(yù)后提供準(zhǔn)確的依據(jù)。自20世紀(jì)80年代末，Pinkel和Heiles將FISH技術(shù)引入染色體檢測(cè)領(lǐng)域后，FISH技術(shù)就在臨床診斷及科研工作中得到了廣泛的運(yùn)用，顯示出與一些傳統(tǒng)技術(shù)相比的明顯優(yōu)勢(shì)。

　　熒光原位雜交fish檢測(cè)與傳統(tǒng)的免疫組織化學(xué)法（IHC）相比，FISH具有良好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。目前免疫組織化學(xué)法正廣泛應(yīng)用于腫瘤等多個(gè)領(lǐng)域的臨床診斷。免疫組化的檢測(cè)對(duì)象是疾病相關(guān)的蛋白。由于蛋白的表達(dá)和本身的構(gòu)象受各種因素的影響很大（例如酸、堿和變性劑），檢測(cè)條件的穩(wěn)定性對(duì)檢測(cè)結(jié)果至關(guān)重要。此外，免疫組化檢測(cè)結(jié)果的判斷依賴于檢測(cè)者對(duì)顯色結(jié)果的主觀判斷，對(duì)于一些弱陽(yáng)性的結(jié)果，不同的檢測(cè)者容易產(chǎn)生分歧。上述的因素都可能影響醫(yī)生對(duì)病情的終診斷。

　　熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)檢測(cè)的對(duì)象是細(xì)胞中的DNA，致密的雙螺旋結(jié)構(gòu)使DNA可以歷經(jīng)千百萬(wàn)年而依然保持良好，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被環(huán)境條件影響，為熒光原位雜交技術(shù)的穩(wěn)定提供了良好的基礎(chǔ)。此外，熒光原位雜交結(jié)果的判定借助于對(duì)熒光的顏色判斷和信號(hào)計(jì)數(shù)，客觀地量化了檢測(cè)地結(jié)果。如果借助于相應(yīng)的FISH操作系統(tǒng)（例如Abbott-Vysis公司的Hybrit雜交儀和VP2000樣本預(yù)處理系統(tǒng)）和染色體成像系統(tǒng)（例如AI公司的CytoVision）就能實(shí)現(xiàn)整個(gè)FISH操作的自動(dòng)化，大限度的降低操作者和檢測(cè)者的主觀因素，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

　　PCR由于靈敏度高，操作簡(jiǎn)便快捷是近年來(lái)應(yīng)用比較多的基因診斷技術(shù)，但PCR診斷技術(shù)的假陰性和假陽(yáng)性的比例較高，對(duì)同一樣本也只能作一次分析，不能重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。隨著探針技術(shù)的不斷發(fā)展，FISH目前的靈敏度已經(jīng)接近或達(dá)到PCR的水平，并能很好彌補(bǔ)PCR技術(shù)的局限。熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)不僅有極低的假陽(yáng)性、假陰性的比例（以Abbott-Vysis的產(chǎn)前診斷探針為例，29,000例的使用結(jié)果證實(shí)正確率高達(dá)99.9％），還能對(duì)同一樣本進(jìn)行多次的FISH操作以及利用不同顏色的熒光探針一次檢測(cè)多個(gè)染色體或基因的異常，大大節(jié)省了檢測(cè)的時(shí)間。此外，通過(guò)FISH可以對(duì)染色體或特定基因的數(shù)目異常，特定片斷的缺失、易位和重排進(jìn)行診斷研究。

　　熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用在產(chǎn)前及植入前、腫瘤的預(yù)前和預(yù)后以及血液類疾病的診斷分型領(lǐng)域。