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免疫組化常見抗原修復(fù)方法

大多數(shù)甲醛固定的組織在開始染色之前都需要先修復(fù)抗原，這是由于在固定過程中產(chǎn)生了亞甲基橋使蛋白之間交聯(lián)屏蔽了抗原位點。兩種抗原修復(fù)方法為熱修復(fù)法（稱之為熱誘導(dǎo)抗原表位修復(fù)或HIER）和酶解法。

一、熱修復(fù)法

1. 熱修復(fù)緩沖溶液

下面是三種HIER較為常用的緩沖溶液，對于一個特定的抗體，在沒有其他研究者建議的情況下，要通過實驗確定選用哪種修復(fù)緩沖液。

1) 枸櫞酸鈉緩沖液(10 mM Sodium Citrate，0.05% 吐溫- 20, pH 6.0)

2) 1 mM EDTA, 調(diào)至pH 8.0

3) Tris/EDTA 緩沖液(10mM Tris, 1 mM EDTA 溶液， 0.05% 吐溫-20, pH 9.0)

2. 熱修復(fù)方法

a)高壓蒸汽法

玻片要置于金屬架上

1)材料及試劑

• 家用不銹鋼高壓鍋

• 加熱板

• 玻片架放置容器（容量大約400-500ml）

• 抗原修復(fù)緩沖液（如Tris/EDTA pH 9.0，枸櫞酸鈉pH 6.0）

2)方法

1. 將合適的抗原修復(fù)緩沖液加入高壓鍋內(nèi)，然后將鍋置于加熱板并開至大功率，此時不要把蓋子蓋緊。在等待煮沸過程中，進(jìn)行脫蠟至水。

2.煮沸后，將玻片從自來水中取出放入高壓鍋內(nèi)。小心熱溶液- 使用鑷子。依照說明書加上加壓閥。

3.高壓鍋達(dá)到大壓力后，維持3分鐘。

4.3min過后，關(guān)掉加熱板，將高壓鍋取下放置。

5.打開高壓鍋閥門，冷水冷卻鍋身。壓力降下后，打開鍋蓋，冷水冷卻10分鐘。

6.繼續(xù)染色。

b) 微波法

1)材料和試劑

• 家用(850W)或科研微波爐

• 微波爐玻片放置架及容器（容量大約400-500ml）或染色缸

• 抗原修復(fù)緩沖液（如Tris/EDTA pH 9.0，枸櫞酸鈉溶液pH 6.0，等等）

2)方法

1.將切片脫蠟至水。

2.向微波爐容器中加入合適的修復(fù)緩沖液。

3.從自來水中取出切片并放入容器中，置于微波爐內(nèi)。如果用家用微波爐，就將之開到大功率至開始沸騰并煮沸20分鐘。如果采用科研微波爐，就將溫度設(shè)置在98°C維持20分鐘以修復(fù)抗原。

4.20分鐘后，取出容器放置水中冷卻10分鐘。小心熱溶液。

5.繼續(xù)染色。

c) 蒸煮鍋法

1）材料和試劑

• 蒸煮鍋

• 玻片放置架及容器（容量大約400-500ml，如果采用Tissue–Tek容器大約250ml）

• 抗原修復(fù)緩沖液（如Tris/EDTA pH 9.0，枸櫞酸鈉溶液pH 6.0，等等）

2）方法

1.將切片脫蠟至水。

2.依據(jù)用戶手冊設(shè)置蒸煮鍋并預(yù)熱。

3.在燒瓶中加熱適量修復(fù)緩沖液并煮沸。

4.將盛放玻片架的容器放置蒸煮鍋中。

5.將熱修復(fù)緩沖液小心加到容器中，然后放入玻片架。也可以采用更簡捷的操作，先向容器中加熱修復(fù)緩沖液再放入蒸煮鍋中。

6.加蓋。盛放緩沖液的容器也須配備蓋子。剛開始時玻片架可能會使修復(fù)溶液溫度降低，但幾分鐘內(nèi)會回升到95-100°C之間。

7.達(dá)到溫度后維持20分鐘。

8.20分鐘后，取出容器放置水中冷卻10分鐘。

9.組織染色。

二．酶解抗原修復(fù)法

 a)滴管法

1）材料和試劑

• 37°C孵育箱

• 加濕器（恒溫箱自帶或在容器內(nèi)放入濕紙巾）

• 兩個盛TBS的玻片架容器

• 酶解抗原修復(fù)溶液（如胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K，等等）

2）方法

1.將胰蛋白酶預(yù)熱至37℃。小心的將組織切片周圍的水吸干，然后吸取酶溶液滴加到切片上（一般50-100µl即可）。用吸管將酶溶液鋪蓋住整個切片，注意不要弄壞組織。

2.將玻片置于加濕器內(nèi)，然后37°C孵育。避免直接將玻片放入恒溫箱架子上，否則會因溫度不均影響染色質(zhì)量。盛放玻片的容器應(yīng)先預(yù)熱再放入恒溫箱內(nèi)。

3.10-20min（需要優(yōu)化）后，取出玻片，流水沖洗3min。

4.繼續(xù)染色。

b) 侵泡法

1）材料和試劑

• 37°C 水浴

• 玻片架及玻片架容器

• 酶解抗原修復(fù)溶液

2）方法

1.將水浴溫度設(shè)置為酶適宜的溫度。向盛放玻片架的兩個容器中加入超純水。容器放入水浴中加熱。

2.按上述方法將切片脫蠟至水后放入水浴箱其中一個容器中加熱。

3.用水浴箱中另一個容器中的熱水制備酶解抗原修復(fù)緩沖液，然后將盛有緩沖液的容器放回水浴箱中重新加熱。

4.將加熱過的玻片放入酶溶液中10-20分鐘并間歇緩慢震蕩。取出玻片在流水下沖洗3分鐘，將酶漂洗干凈。

5.繼續(xù)染色。